細胞活力=活細胞數/細胞總數×,常用臺盼藍法、MTT法或者CFSE法進行細胞活力檢測。
臺盼藍法
原理:活細胞不被染色,死細胞被染成藍色。
方法:500ul細胞懸液加入500ul 0.4%臺盼藍染液,染色2-3分鐘;將少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片,顯微鏡下取幾個視野分別統計死細胞和活細胞數,計算細胞活力。
MTT法
原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可使外源性MTT分解產生水不溶性藍色結晶狀甲瓚顆粒(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。DMSO溶解甲瓚后,用酶聯**檢測儀在540nm或720nm波長處測定其吸收值,可間接反映活細胞數量。可用于生物活性因子的活性檢測、大規模的**篩選、細胞毒性試驗鑒定等。
方法:將細胞懸浮液以1000-10000個細胞接種到96孔板,每孔體積200ul,培養細胞3-5d(依據實驗目的和要求決定培養時間)后,每孔加入MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul,37℃溫箱中孵育4h后,小心去上清,加入150ul DMSO溶解后,用酶標儀進行檢測。(市場上售賣的CCK8試劑盒,便是對MTT法的一種優化)。
CFSE法
原理:CFSE進入活細胞后,可與胞內蛋白共價結合,水解后釋放出綠色熒光。CFSE隨著細胞分裂而平均分配至子代細胞中,而導致熒光強度逐級遞減,依據這一特性,可被用于檢測細胞增殖活力。
方法:制備細胞懸液后,加入等體積的CFSE工作液(2.5-5uM),于37℃孵育10 min,用10倍體積的預冷的基礎培養基(不加血清)立即終止標記10min。用PBS離心洗滌兩次后,用適量的培養液重懸細胞。培養一段時間后,離心收細胞,用PBS洗兩次并重懸后,上流式儀器檢測熒光強度的稀釋比例。
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