實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)原理：將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性、適溫延伸的熱循環(huán)，并遵循聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補(bǔ)配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在指定光激發(fā)下發(fā)出熒光；當(dāng)循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實(shí)時(shí)檢測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），同時(shí)利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR主營事項(xiàng)：1.控制加量誤差：使用加樣器時(shí)，應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)，避免反復(fù)調(diào)檔，以減少系統(tǒng)誤差，加量的準(zhǔn)確。若需調(diào)檔，應(yīng)順時(shí)針緩慢調(diào)動；對常用量應(yīng)設(shè)專檔專用。
2.標(biāo)本處理：標(biāo)本的處理對FQ—PCR測定核酸模板的成功提取具有決定性作用。此過程主要為手工，在操作中要格外小心，嚴(yán)防交叉污染，避免吸入雜質(zhì)，特別是每類標(biāo)本都有各自標(biāo)準(zhǔn)化的處理程序，應(yīng)嚴(yán)格遵循每個步驟的要求。另外，一次性用品的選擇很重要，如離心管、吸頭的質(zhì)量要嚴(yán)格要求，嚴(yán)格**，避免雜質(zhì)及其它病原微生物成為擴(kuò)增的對象而造成結(jié)果的偏差。
3.標(biāo)本的適當(dāng)保存：標(biāo)本的保存對于核酸擴(kuò)增測定的有效性極為重要。標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢，不同標(biāo)本的保存方法各異。若不能及時(shí)檢測通常在-20至-70℃的條件下保存，避免反復(fù)凍融（若凍融1次病原數(shù)量明顯減少從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性下降）。
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