1. 一抗,二抗的比例怎么樣?
解答:比較重要,調整好一抗,二抗的比例,去掉部分非特異的本底。
2. 做細胞信號傳導,要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求?
解答:對二抗無要求,根據實驗條件來選擇,一般選HRP標記的二抗。
3. 公司內的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好,所以沒做預試,怕費時間,用什么樣的稀釋度比較好呢?我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜,一抗孵育也是過夜的,若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。
解答:不同抗體,即使是同一公司的抗體,其佳的抗體稀釋度也是不一樣的,需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧,轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦,何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間,還要看你的目的蛋白分子量的大小;轉膜的設備,是半干式,還是濕式。一抗當然可以過夜,如果你想所短Western Blot時間的話,可以增高一抗的孵育溫度,我們實驗室一般37度,兩小時就足夠了;你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度,你可以一抗1:1500;二抗1:20000試試。另外建議你洗膜時,多洗幾次,好是在封閉;一抗和二抗后至少是5x5min,跑一張好膜不容易,多盡點心吧,這樣不會浪費你的時間,只會節省你的時間!
4. **組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?
解答:**組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于**組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于**組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。(限于單抗)
5. Western Blot 中抗體的重復應用問題
解答:抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內使用,4度保存,避免反復凍融。
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