1. 一抗，二抗的比例怎么樣？

解答：比較重要，調整好一抗，二抗的比例，去掉部分非特異的本底。

2. 做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：對二抗無要求，根據實驗條件來選擇，一般選HRP標記的二抗。

3. 公司內的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜，一抗孵育也是過夜的，若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。

解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧，轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦，何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間，還要看你的目的蛋白分子量的大小；轉膜的設備，是半干式，還是濕式。一抗當然可以過夜，如果你想所短Western Blot時間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實驗室一般37度，兩小時就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時，多洗幾次，好是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點心吧，這樣不會浪費你的時間，只會節省你的時間！

4. **組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

解答：**組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于**組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于**組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）

5. Western Blot 中抗體的重復應用問題

解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。

目前，基爾頓生物科技（上海）有限公司，主營實驗設計服務、服務、動物模型構建、細胞株、elisa試劑盒等，歡迎廣大科研愛好者前來咨詢！