基爾頓生物科技（上海）有限公司
JRDUN Biotechnology(Shanghai)Co.,Ltd
實(shí) 驗(yàn) 報(bào) 告
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訂單編號 JRD20150514XXXX
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業(yè)務(wù)員 XXX
實(shí)驗(yàn)員
HE染色實(shí)驗(yàn)報(bào)告
前言
HE染色法，即是蘇木精-伊紅染色法。石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中基本、使用廣泛的技術(shù)方法。
易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)稱為嗜堿性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而對堿性染料和酸性染料親和力都比較弱的現(xiàn)象稱為中性（neutrophilia)。組織內(nèi)的蛋白質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的種類很多，它們有不同的等電點(diǎn)。在普通染色法中，染色液的酸堿度為pH6左右，細(xì)胞內(nèi)的酸性物質(zhì)如細(xì)胞核的染色質(zhì)、腺細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及透明軟骨基質(zhì)等均被堿性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜堿性。而細(xì)胞質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)如紅細(xì)胞中的血紅蛋白、嗜酸粒細(xì)胞的顆粒及膠原纖維和肌纖維等被酸性染料染色，這些物質(zhì)稱為嗜酸型。如果改??染色液的酸堿度，pH值升高時，則原來被酸性染料染色的物質(zhì)可變?yōu)槭葔A性；pH值降低時，原來被堿性染料染色的物質(zhì)則可變?yōu)槭人嵝浴Ｋ哉f染色液的pH值可以影響染色的反應(yīng)。
脫氧核糖核酸（DNA）兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵結(jié)合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍(lán)色，所以細(xì)胞核被染成藍(lán)色。伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷的陽離子結(jié)合使胞漿染色，細(xì)胞漿、紅細(xì)胞、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明對比。伊紅是細(xì)胞漿的良好染料。
由于組織或細(xì)胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質(zhì)不一樣。經(jīng)蘇木精染色后，細(xì)胞核及鈣鹽粘液等呈藍(lán)色，可用鹽酸酒精分化和弱堿性溶液顯藍(lán)，如處理適宜，可使細(xì)胞核著清楚的深藍(lán)色，胞漿等其它成分脫色。再利用胞漿染料伊紅染胞漿，使胞漿的各種不同成分又呈現(xiàn)出深淺不同的粉紅色。故各種組織或細(xì)胞成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均可顯示出來。
染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。
圖1 HE染色結(jié)果示意圖
材料與方法
1.1 主要試劑
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試劑名稱
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廠家
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貨號
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石蠟
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上海國藥集團(tuán)
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69018961
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甲醛
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上海國藥集團(tuán)
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10010018
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二甲苯
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上海國藥集團(tuán)
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10023418
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無水乙醇
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上海國藥集團(tuán)
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10092680
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氨水
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上海國藥集團(tuán)
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10002118
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蘇木素
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BASO
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714094
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伊紅
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BASO
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BA4099
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中性樹脂
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上海長島生物技術(shù)有限公司
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G8590
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1.2 主要儀器及耗材
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儀器名稱
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廠家
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型號
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正置顯微鏡
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OLYMPUS公司
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CX41
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移液器
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吉爾森P型移液器公司
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P2、P10、P20、P100、P200、P1000
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恒溫烘箱
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上海恒一科學(xué)儀器有限公司
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DHG-9023A
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石蠟切片機(jī)
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徠克公司
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SQ2125
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攤片機(jī)
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徠克公司
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PPTHK-21B
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IMS圖象分析系統(tǒng)
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基爾頓生物科技（上海）有限公司
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數(shù)碼相機(jī)
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NIKON公司
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D5100
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2方法
2.1樣本包埋與固定
2.1.1取材和固定
切取組織時應(yīng)使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時，從刀的根部開始向后拉動切開組織。組織塊的厚度約為0.2~0.3cm，大小為1.5cm×1.5cm x 0.3cm為宜。取好的組織塊置于10%福爾馬林中固定48小時；
2.1.2洗滌與脫水
將固定后的組織用流水沖洗，去除殘留的固定液和雜質(zhì)。不同濃度的乙醇逐級脫水，50%、70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每級2小時。脫水在有蓋的瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。
2.1.3透明
將組織塊置入純乙醇和二甲苯的等體積混合液中2小時，再進(jìn)入純二甲苯兩小時，再一次純二甲苯兩小時；材料經(jīng)過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。
2.1.4浸蠟
浸蠟須在恒溫箱中進(jìn)行。先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1～2小時，再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬各3小時左右；
2.1.5包埋
包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒，將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨校蛊溲杆倮鋮s凝固，30min后取出。
2.1.6切片
切片前將蠟塊在-20度冰箱中至少放置30min，以增加硬度。將切片刀裝在刀片機(jī)的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。調(diào)整切片機(jī)上的切片厚度為4-7μm，然后切片。
2.2 HE染色
2.2.1烤片和脫蠟
將玻片置于65℃恒溫烘箱中烤片30min；置于二甲苯I中浸泡15min，再置于二甲苯II 中浸泡15min。
2.2.2水化
將脫蠟后的切片經(jīng)酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精分別浸泡5min，自來水沖洗10min。
2.2.3蘇木素染色
將已入蒸餾水后的切片放入蘇木素水溶液中染色5min，氨水中分色，數(shù)秒鐘。流水沖洗15min，入70％和90％酒精中脫水各10min。
2.2.4伊紅染色
入酒精伊紅染色液染色1-2min，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水。
2.2.5透明和封片
將玻片置于二甲苯中透明3min×2次，中性樹膠封片，放入65℃烘箱中15min。
2.3 圖像采集和分析
通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。