近年來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)和**學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域；細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，包括動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和植物細(xì)胞培養(yǎng)；筆者以HepG-2肝癌細(xì)胞為例簡(jiǎn)要介紹腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)方法和細(xì)胞污染的來(lái)源及類(lèi)型，以及培養(yǎng)過(guò)程中容易出現(xiàn)的問(wèn)題。

細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)(Cell Culture Technique) 是指從體內(nèi)取出單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群，通過(guò)模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使之在體外生存、生長(zhǎng)和繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法；近年發(fā)展起來(lái)的細(xì)胞雜交、核移植和DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移以及基因圖譜的建立，無(wú)不與細(xì)胞培養(yǎng)緊密結(jié)合；掌握細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)要點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)方法和條件，并探討細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)方法和注意事項(xiàng)，是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵內(nèi)容。

1、細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境

細(xì)胞生長(zhǎng)的佳pH 值為7.0～7.2，其可耐受的pH值范圍為6.6～7.8，如果培養(yǎng)液的pH值小于6.6或大于7.8 時(shí)，則會(huì)抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)甚至引起死亡。細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是培養(yǎng)液的設(shè)計(jì)，培養(yǎng)液可以提供細(xì)胞體外生存所需要的pH值、滲透壓、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和相關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)。恒溫培養(yǎng)箱是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的重要場(chǎng)所，其內(nèi)部溫度應(yīng)維持在37℃、CO2濃度5 %（根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的不同而存在差別），以及100 %的飽和濕度；CO2既是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，也是細(xì)胞增殖所需成份，并可對(duì)培養(yǎng)液的PH值起到調(diào)節(jié)的作用。另外，在培養(yǎng)箱底部的水盤(pán)中放入飽和硫酸銅溶液可以起到抑制**生長(zhǎng)的作用。

2、細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮中取細(xì)胞時(shí)佩戴棉手套，液氮溫度可達(dá)-196℃，不做防護(hù)會(huì)對(duì)皮膚造成損傷。不同復(fù)蘇方法細(xì)胞的存活率不同，我們?cè)趶?fù)蘇HepG-2細(xì)胞時(shí)采用先40℃溶解后37℃恒溫培養(yǎng)的方法，此法比傳統(tǒng)的37℃水浴溶解后培養(yǎng)的方法細(xì)胞存活率高，在溶解過(guò)程中需要用鑷子夾住凍存管不停地?fù)u動(dòng)，使凍存管內(nèi)的細(xì)胞均勻受熱融化；細(xì)胞凍存液中含有10％的二甲基亞砜（DMSO），是一種重要的滲透性細(xì)胞保護(hù)劑，其能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低冰點(diǎn)和延緩凍存過(guò)程，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少對(duì)細(xì)胞的損傷；常溫下DMSO對(duì)細(xì)胞的毒副作用較大，如果復(fù)蘇時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，在1-2 min內(nèi)使凍存液融化；解凍的細(xì)胞應(yīng)先緩慢加入5倍體積含血清的培養(yǎng)液，然后1000轉(zhuǎn)離心5min，棄上清，以去除細(xì)胞凍存液中DMSO對(duì)細(xì)胞活力的損害，再向凍存管中加入含血清的培養(yǎng)液，緩慢吹打混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)入已經(jīng)37℃預(yù)溫的培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步培養(yǎng)。（注意用移液槍吹打細(xì)胞時(shí)應(yīng)慢吸輕吹，因?yàn)閯倓倧?fù)蘇的細(xì)胞比較脆，容易破碎。）

3、細(xì)胞貼壁不均勻

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中我們常見(jiàn)到細(xì)胞貼壁不均勻的現(xiàn)象，我們對(duì)比了兩種操作方法細(xì)胞的貼壁情況，以直徑為10cm的大培養(yǎng)皿為例，一種方法是收集細(xì)胞于離心管，加入適量的培養(yǎng)液（1-2mL），吹打混勻，移到培養(yǎng)皿，加入6-7mL培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中，再吹打混勻；另一種方法是收集細(xì)胞于離心管，加入8mL培養(yǎng)液，吹打混勻，再移到培養(yǎng)皿；通過(guò)比較我們發(fā)現(xiàn)種方法細(xì)胞鋪的更均勻，聚集在一起的細(xì)胞很少；鋪完細(xì)胞后不用走8字的方法混勻，此法細(xì)胞隨液體晃動(dòng)幅度太大，細(xì)胞很容易發(fā)生再次聚集的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不均勻；我們采用輕微地小幅度晃動(dòng)幾下后放入培養(yǎng)箱。

4、細(xì)胞傳代

HepG2肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)方式是單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞生命呈現(xiàn)周期性變化，主要分為三期：潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞呈現(xiàn)密度抑制和接觸抑制的特點(diǎn)。細(xì)胞在原代培養(yǎng)1~4周后，由于細(xì)胞生存空間不足和或密度過(guò)大，可引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和繁殖，此時(shí)需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。有研究報(bào)道：1967年，Van Wezel提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng)，是將一種對(duì)細(xì)胞無(wú)毒、無(wú)害的特殊顆粒放到培養(yǎng)液中，這種顆粒被稱(chēng)為微載體，大量的微載體使細(xì)胞可以在其表面附著生長(zhǎng)，大大增加細(xì)胞生長(zhǎng)的面積，并獲得良好的生長(zhǎng)環(huán)境，便于獲得高密度培養(yǎng)細(xì)胞；此種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求比較高，筆者所在實(shí)驗(yàn)室并未開(kāi)展。

5、細(xì)胞消化

有研究者對(duì)EDTA、胰酶和EDTA+胰酶三種消化細(xì)胞的方法進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)胰酶消化細(xì)胞的效果好。胰酶是一種蛋白酶，通過(guò)在特定部位降解蛋白，使細(xì)胞膜上和培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，同時(shí)細(xì)胞在其自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下恢復(fù)為球形，從而脫離培養(yǎng)皿。胰酶溶液在pH值為8.0、溫度為37℃時(shí)其作用能力強(qiáng)，消化前要用PBS緩沖液洗細(xì)胞2次，目的是洗掉之前培養(yǎng)液中的血清，否則影響胰酶的消化效果；我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中曾經(jīng)發(fā)生過(guò)此類(lèi)現(xiàn)象，導(dǎo)致貼壁的細(xì)胞很難被消化下來(lái)；在消化細(xì)胞時(shí)以胰酶剛好覆蓋細(xì)胞表層為宜，將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中1-2min，消化過(guò)程中要隨時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，如在鏡下觀察到50%~70%的細(xì)胞形狀變成圓形并與培養(yǎng)皿脫離，則立刻向培養(yǎng)皿中加入含血清的培養(yǎng)液終止消化（胰酶與血清蛋白結(jié)合阻礙了其消化細(xì)胞的過(guò)程，從而達(dá)到終止消化的目的）；消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、形態(tài)不規(guī)則和狀態(tài)不佳等現(xiàn)象。我們還采用另外一種消化方法：加入胰酶輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，讓胰酶充分與細(xì)胞表面接觸，接觸1 min左右，肉眼觀察待瓶底發(fā)白迅速吸掉胰酶，輕拍瓶底這樣細(xì)胞就會(huì)從瓶底脫落下來(lái)，此時(shí)加入培養(yǎng)液輕輕吹打，后將脫落的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其它瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)；此法不用離心，簡(jiǎn)化操作對(duì)細(xì)胞損傷小，初學(xué)者需要掌握消化時(shí)間后，才能達(dá)到更好的效果。

6、細(xì)胞凍存

我們采用DMSO和胎牛血清按1：9的比例配成凍存液。凍存液用前要無(wú)菌；準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞是無(wú)污染的、且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入細(xì)胞凍存液時(shí)要緩慢，防止出現(xiàn)滲透性休克。細(xì)胞凍存采用慢速冷凍的方法，在DMSO的作用下，可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，防止產(chǎn)生過(guò)多的冰晶損傷細(xì)胞。計(jì)算機(jī)程序性降溫為較好的降溫方法，如果條件不允許，可采用傳統(tǒng)方法，4℃ 5~10min（如果凍存管可以用脫脂棉包裹則凍存效果更好），-20℃ 0.5~2 h，-80℃過(guò)夜，然后移入液氮凍存。

7、細(xì)胞污染來(lái)源

細(xì)胞污染來(lái)源很多，概括起來(lái)有兩類(lèi)，即外源性污染和內(nèi)源性污染。

7.1 外源性污染：

7.1.1 操作環(huán)境的污染：細(xì)胞無(wú)菌操作室、超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱、冰箱、水浴箱和顯微鏡載物臺(tái)等長(zhǎng)時(shí)間未清理或不符合無(wú)菌要求；培養(yǎng)箱中的水盤(pán)沒(méi)有及時(shí)清洗、沒(méi)有及時(shí)更換高壓**的三蒸水、沒(méi)有定期紫外照射**等；我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)箱水盤(pán)中加入硫酸銅粉末制成飽和溶液，這樣能夠顯著減少水盤(pán)的污染。

7.1.2 操作者本身：防護(hù)服**沒(méi)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)或穿戴不規(guī)范，操作人員對(duì)細(xì)胞操作不規(guī)范或其本身帶有病原體，在無(wú)菌室來(lái)回大幅度走動(dòng)大聲喧嘩都會(huì)引起細(xì)胞污染；

7.1.3 實(shí)驗(yàn)器材和培養(yǎng)液的污染：實(shí)驗(yàn)器材清洗不干凈、**不、長(zhǎng)時(shí)間存放，槍頭不及時(shí)更換均可造成二次污染，培養(yǎng)液過(guò)濾不，血清可帶來(lái)支原體污染和病毒污染，未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清和生長(zhǎng)輔助因子等都可能成為污染的來(lái)源；培養(yǎng)液的配制應(yīng)做到少量多次，即一次配制用幾天的，用完再配，避免一次配制的量過(guò)大而長(zhǎng)期使用，這樣容易造成污染。

7.1.4 細(xì)胞之間的交叉污染：主要源于細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)細(xì)胞株種類(lèi)較多，易導(dǎo)致細(xì)胞之間相互污染。

7.2 內(nèi)源性污染：

細(xì)胞建株時(shí)的污染，主要是細(xì)胞的組織或器官本身帶有病毒或支原體。

8、污染類(lèi)型及識(shí)別

8.1 霉菌污染：培養(yǎng)液中可見(jiàn)到淡黃色或白色的漂浮物，鏡下可以看見(jiàn)細(xì)胞之間有絲狀或管狀菌絲漂浮在培養(yǎng)液中，短期內(nèi)培養(yǎng)液一般不變混濁。

8.2 **污染：**在普倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，培養(yǎng)液渾濁呈現(xiàn)黃色，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有較大影響。

8.3 **污染：鏡下有絲狀物，看上去像死細(xì)胞碎片或珊瑚狀，慢慢變成黑色絲狀，培養(yǎng)液無(wú)明顯變化。

8.4 支原體：黑色的，以不同的形狀出現(xiàn)，一般培養(yǎng)液會(huì)變渾濁，支原體常見(jiàn)于牛血清中，而且它不能用過(guò)濾的辦法除去。支原體感染的細(xì)胞沒(méi)有明顯特征，后可導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡。

8.5 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中也曾出現(xiàn)過(guò)黑膠蟲(chóng)，在高倍鏡下能看見(jiàn)其有不規(guī)則的運(yùn)動(dòng)，有的在原地打轉(zhuǎn)，有的像在蠕動(dòng)，對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞基本無(wú)影響。

結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為一種日趨成熟的研究方法，無(wú)論在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面都越來(lái)越受到生物技術(shù)界的重視，在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛，熟練掌握細(xì)胞培養(yǎng)的方法和條件，靈活使用并不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，了解并解決培養(yǎng)過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題，終實(shí)現(xiàn)低成本、高密度細(xì)胞培養(yǎng)的目標(biāo)，目前已經(jīng)建立起應(yīng)用于不同環(huán)境、實(shí)現(xiàn)不同目的細(xì)胞培養(yǎng)的裝置，相信隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在不久的將來(lái)會(huì)進(jìn)入一個(gè)嶄新的階段。